甲氨蝶呤具有廣譜抗腫瘤活性 ，可單獨應用或與其它化療藥物聯合使用 。具體適應症如下 ：

1.抗腫瘤治療 ，單獨使用 ：乳腺癌 ，妊娠性絨毛膜癌 ，惡性葡萄胎或葡萄胎 。

2.抗腫瘤治療 ，聯合使用 ：急性白血病(特別是急性淋巴細胞性白血病或急性髓細胞性白血病) ，Burkitts淋巴瘤 ，晚期淋巴肉瘤(III和IV期 ，Peter氏階段系統)和晚期蕈樣黴菌病 。

3.鞘內注射 ：治療中樞神經系統轉移癌(只能使用等滲製劑) 。

4.大劑量治療 ：大劑量甲氨蝶呤單獨應用或與其它化療藥物聯合應用治療下列腫瘤 ：成骨肉瘤 、急性白血病 、支氣管肺癌或頭頸部上皮癌 。大劑量甲氨蝶呤應用時, 必須應用亞葉酸進行解救 。亞葉酸是四氫葉酸酯的衍生物 ，可與甲氨蝶呤競爭進入細胞內 。這種「亞葉酸解救」可在大劑量甲氨蝶呤應用時保護正常組織細胞免受損害 。

5.銀屑病化療 ：甲氨蝶呤可用於治療嚴重 、已鈣化性 、對常規療法不敏感的致殘性銀屑病 。但因使用時有較大危險 ，應在經過活檢及皮膚科醫生確診後使用 。